陈列平Nature最新综述：深刻反思，PD-1联合疗法临床试验
6月14日，肿瘤免疫疗法先驱、耶鲁大学医学院陈列平教授与Tae Kon Kim、Esten N. Vandsemb及Roy S. Herbst三位科学家在Nature Reviews Drug Discovery杂志上发表了题为“Adaptive immune resistance at the tumour site: mechanisms and therapeutic opportunities”的Perspective文章，讨论了为什么定义肿瘤部位的适应性免疫抵抗（AIR）机制应该是指导未来药物开发的关键焦点，以及改善当前癌症治疗的实用方法有哪些。
免疫反应可以识别、响应并消灭癌细胞。然而，在癌症发展过程中，各种细胞和分子机制发展（尤其是在肿瘤部位），以适应免疫环境的变化，并最终克服免疫攻击，使癌细胞持续生长。这些机制统称为适应性免疫抵抗(adaptive immune resistance，AIR)，是癌细胞经过长期适应的结果。
目前的肿瘤免疫治疗主要是基于抗PD-1/PD-L1疗法（阻断PD-L1与PD-1结合的疗法），这类疗法已经在晚期人类癌症（尤其是难治性实体瘤）的治疗中处于中心地位，已有明确的临床证明表明，抗PD-1/PD-L1疗法是有效的，甚至可以治愈一部分患者。不过，总体来看，能够获益于这类疗法的患者比例依然有限，据估计，平均25%的实体瘤患者对当前的抗PD-1/PD-L1疗法有响应，因此制药行业、临床医生和学术研究人员也一直致力于改善这种疗法的疗效，最主要的策略是“联合治疗”，然而，到目前为止，这些努力只换来了微小的进展。
在这篇Perspective中，作者们希望传达这样一个观点：在癌症患者亚群中发现基础的适应性免疫抵抗(AIR)机制将指导未来更有效的癌症免疫治疗，而不是像现在这样把精力投入到无穷无尽的联合临床试验中。
AIR的分类
这篇文章基于肿瘤免疫微环境(tumour immune microenvironment，TIME)提出了4种不同的人类癌症类型，具体基于PD-L1的表达和TILs(肿瘤浸润淋巴细胞, 主要基于CD8+T细胞)的存在分为：
I型：PDL1−/TIL−，即PD-L1阴性，无TILs的肿瘤；
II型：PDL1+/TIL+，即PD-L1阳性，有TILs存在的肿瘤；
III型：PDL1−/TIL+，即PD-L1阴性，有TILs存在的肿瘤；
IV型：PDL1+/TIL−，即PD-L1阳性，无TILs的肿瘤。
这4种不同的肿瘤免疫微环境(TIME)类型可能与潜在的适应性免疫抵抗(AIR)机制有关。
——原发性耐药
II型肿瘤（PDL1+/TIL+）被寄予响应抗PD-1/PD-L1疗法的厚望，在黑色素瘤、肺癌和膀胱癌中，与PD-L1−肿瘤相比，PD-L1+肿瘤与抗PD-1/PD-L1疗法的更高应答率相关。不幸的是，TILs的存在，尤其是CD8+T细胞的存在，还没有被用作预测生物标志物来选择患者。因此，PD-L1+肿瘤包括在TIME II型和IV型中，由于IV型肿瘤不存在T细胞浸润，预期不会对抗PD-1/PD-L1疗法有响应，因此，抗PD-1/PD-L1疗法的原发性耐药不能仅根据PD-L1阳性来确定，如果是这样，那将是不准确的。
虽然TILs的存在似乎是必要的，但目前仍不清楚是哪些关键的细胞成分（以及TILs上分子组成）决定了原发性耐药。肿瘤微环境（TME）中CD8+和TH1细胞的存在始终与更好的预后相关，这些细胞可能是预防原发性耐药的必要细胞成分。然而，其他TILs成分包括CD4+T细胞、自然杀伤(NK)细胞、NKT细胞、B细胞、Treg细胞、γδ T细胞以及先天淋巴细胞亚群在TME中的作用尚不清楚。对II型TIME的细胞和分子的综合分析将有助于我们鉴定对抗PD-1/PD-L1疗法原发性耐药的高风险患者。
——获得性耐药
四分之一到三分之一的转移性黑色素瘤患者最初对抗PD-1/PD-L1疗法有反应，随着时间的推移复发。在肺癌中也观察到类似的复发。因此，这些患者表现出对抗PD-1/PD-L1疗法的获得性耐药。目前还没有明确的生物标志物或临床标准来预测复发，也没有报道收集大量病例来论证抗PD-1/PD-L1疗法获得性耐药的共同机制。这在临床实践中是一个紧迫的挑战。
临床观察为获得性耐药可能的潜在机制提供了一些线索，获得性耐药的患者仍然可能是PD-L1和PD-1表达阳性(这是浸润T细胞激活表型的标志)。有趣的是，在某些情况下，复发患者在停止治疗一段时间或化疗后，可以重新获得对抗PD-1/PD-L1疗法的反应。在这些病例中，获得性耐药不能用归因于肿瘤抗原突变或丢失引起的变异来解释。然而，肿瘤细胞可能会发生内在变化，从而降低对免疫攻击的敏感性。
在一小部分复发患者中，功能丧失突变与获得性耐药相关，如JAK1和JAK2的功能丧失突变和β2-微球蛋白(β2m)基因B2M的截断突变。这些突变与抗PD-1/PD-L1疗法的不良响应有关，因为干扰素信号介导的癌细胞死亡需要JAK通路的激活，而B2M的突变会降低主要组织相容性复合体(MHC) I类的表达。这些突变与抗PD-1/PD-L1疗法的响应不良有关，因为干扰素信号介导的癌细胞死亡需要JAK通路的激活，而B2M的突变会降低主要组织相容性复合体(MHC) I类的表达。然而，尽管这些关于免疫相关分子功能丧失的报告提供了获得性耐药甚至原发性耐药的可信例子，但这些事件的发生频率很低，其因果关系仍有待确定。其他抑制分子的上调也已被报道为获得性耐药的潜在机制，如T细胞抑制性受体HAVCR2（也被称为TIM3）的表达增加。
——靶点缺失耐药
由于抗PD-1/PD-L1疗法是通过阻断PD-1和PD-L1之间的相互作用来起作用的，所以在理论上，TME中缺乏其中一种或两种蛋白的表达将不允许这种疗法发挥作用。缺乏PD-1或PD-L1表达的肿瘤都被归类为“靶点缺失”，因此，观察到I、III和IV型TIME患者对抗PD-1/PD-L1疗法响应较差并不奇怪。而靶点缺失耐药发生在60%–85%的实体瘤中（表1）。这就是为什么只有一小部分患者对抗PD-1/PD-L1疗法有响应的主要原因。
表1 不同类型癌症中肿瘤免疫微环境（TIME）类型总结
值得一提的是，这篇文章强调，目前这样的TIME分类仅仅只是个开始，随着导致AIR的新分子途径的发现以及对肿瘤微环境中免疫应答状态的了解不断增加，预计将建立上述四种主要类型的进一步亚型，以准确预测患者对免疫治疗的应答。
当前的联合疗法
目前，在探索免疫疗法与其他药物联合治疗的临床试验中，抗PD-1/PD-L1疗法是最常见的支柱，成千上万的临床试验正在进行中，以研究与抗PD-1/PD-L1疗法可能的联合效果。2017年9月，共有1502项临床试验评估抗PD-1/PD-L1疗法联合治疗，4年后，调查抗PD-1/PD-L1疗法的活跃临床试验多达4,897项，其中，超80%涉及联合治疗。
在研的各种组合中，化疗、抗CTLA-4疗法以及靶向治疗是最常见的三个合作伙伴。随着临床试验激增，许多临床试验在联合用药和患者人群方面存在大量重叠，跟踪所有试验组合、中期分析结果和最终公布的数据是一项挑战。这篇文章在表2中列出了一些已发表的研究联合免疫疗法的III期临床试验，主要集中在联合抗PD-1/PD-L1疗法与抗CTLA-4疗法、化疗或靶向治疗的临床试验。
表2 抗PD-1/PD-L1疗法的代表性联合试验
——与抗CTLA-4疗法联合
在小鼠模型中观察到的CTLA-4单抗与抗PD-1/PD-L1疗法联合的协同效应被解释为非重叠机制的结果：CTLA-4抑制剂抑制Treg细胞，启动de novo T细胞应答，而抗PD-1/PD-L1疗法主要通过改善TME中的效应T细胞功能发挥作用。然而，临床结果与在小鼠肿瘤模型中观察到的结果有很大不同。在一些试验中，这一组合似乎最多在临床反应中具有附加效应，而各种副作用，包括自身免疫相关不良事件的严重程度显著增加。
——与化疗联合
众所周知，标准化疗对高度增殖细胞有广泛的细胞毒性作用，特别是对造血和免疫系统。因此，系统性化疗被认为是免疫疗法的天敌。然而，一些研究表明，某些化疗药物，如果使用得当，可以通过消除Treg细胞来促进T细胞免疫，以及增加肿瘤细胞死亡时抗原释放，从而能够刺激T细胞介导的免疫。最近的结果支持通过在抗PD-1/PD-L1疗法的基础上增加化疗来实现额外的抗肿瘤反应的可能性。举例来说，一项针对转移性NSCLC患者的III期试验将K药联合化疗，与仅化疗治疗进行了比较，结果显示，联合组12个月的OS(69.2%)较单独化疗组(49.4%)有所改善。无论PD-L1肿瘤表达如何，在所有组中都观察到OS增加。在小细胞肺癌(SCLC)和三阴性乳腺癌的几项III期临床试验中也观察到了类似的结果。
尽管这些组合显示出一定的生存优势，一个关键的问题仍然没有解决：化疗是否会损害抗PD-1/PD-L1疗法，比如对免疫细胞产生细胞毒性。为了解决这一问题，需要将抗PD-1/PD-L1疗法联合化疗与抗PD-1/PD-L1疗法单药治疗进行比较。另一个值得关注的问题是化疗对抗PD-1/PD-L1疗法的长期影响。例如，效应T细胞可以分化为记忆细胞，这对长期免疫保护至关重要。目前，尚不清楚化疗是否会对长期记忆免疫细胞的产生产生不利影响，因此更好地了解化疗如何影响免疫系统对未来的临床试验至关重要。
——与靶向治疗联合
用小分子靶向细胞内负责细胞生长或生存的信号通路已被证明对快速缩小肿瘤体积有效。然而，许多这类药物并没有持久的作用，这主要是由于其他代偿途径的出现。这一特点似乎与抗PD-1/PD-L1疗法互补，抗PD-1/PD-L1疗法可以产生长期效果，但通常需要数月的时间让免疫细胞在TME中生存和协调它们的功能。
靶向治疗既能抑制肿瘤生长，又不会对免疫系统造成不利影响，因此是与抗PD-1/PD-L1疗法相结合的潜在选择。在keynotes-426试验（NCT02853331）中发现K药联合axitinib (一种小分子酪氨酸激酶抑制剂)优于sunitinib单药治疗后（ORR 59.3% vs 35.7%；中位PFS 15.1 vs 11.1个月；出现≥3级毒性的病例 75.8% vs 70.6%），FDA批准了K药联合axitinib治疗晚期RCC。
目前，各种靶向治疗与抗PD-1/PD-L1疗法的组合正在临床试验中进行测试，包括BRAF和MEK抑制剂，EGFR、ALK、ROS1抑制剂等。
综上，作者们认为，目前来自数以千计的联合疗法的临床结果并没有提供一种疗法，既能够以理想的协同效应（至少完全的累加效应）来增强疗效，还不会带来更多的不良事件。与其继续各种现有疗法与免疫疗法的组合，不如更好地理解TME背景下的基础癌症免疫学和癌症生物学，这可能是解决问题的关键。
未来的联合疗法
对于未来的联合策略，这篇文章指出了三个方向：1）改变TME；2）阻断免疫抑制机制；3）增强T细胞介导的免疫。具体如下：
——改变TME
1、局部放疗
放疗可以对组织和细胞产生深远的影响。除了破坏细胞外，它还会触发先天免疫，随后在某些情况下会促进免疫细胞浸润到肿瘤中。肿瘤的局部放疗也可能导致同一患者未暴露于辐射的其他肿瘤的系统性消退，这种观察称为远端效应，归因于受辐射肿瘤诱导的系统性免疫。然而，这种效果非常罕见（<1% 的患者）。放疗还可以在肿瘤中诱导 PD-L1 表达。在小鼠模型中观察到了放疗与抗PD-1/PD-L1疗法联合的协同抗肿瘤作用，包括放疗产生的远端效应与抗PD-1/PD-L1疗法的协同。在与抗PD-1/PD-L1疗法联合时，放疗的剂量、位置、时间等参数，以及增强放疗免疫效应的其他新工具正在被积极研究。
理论上，放疗应该适合I型和IV型TIME肿瘤患者，以产生de novo炎症。在II 型和III型TIME肿瘤中不应考虑或应谨慎应用放疗，因为辐射可能会损害现有的TILs。
2、溶瘤病毒局部给药
使用溶瘤病毒治疗癌症的最初原理是基于一些病毒仅在癌细胞中复制而不在正常细胞中复制这样的事实。除了病毒固有的溶瘤特性外，很多团队将一些修饰应用于某些溶瘤病毒候选产品，以调节免疫反应，如插入细胞因子、重组抗体、T 细胞衔接配体和肿瘤抗原。举例来说，talimogene laherparepvec (T-VEC) 是 1 型单纯疱疹病毒的改良版本，可选择性地在肿瘤内复制并产生粒细胞 - 巨噬细胞集落刺激因子 (GM-CSF)。T-VEC 还可触发树突状细胞分化，增强抗原呈递并促进 T 细胞活化和/或浸润。因此，使用这类药物（尤其是局部给药）将“靶点缺失”型TIME（I、III 和 IV）转化为 II 型TIME，进而使肿瘤对抗PD-1/PD-L1疗法敏感是一种有吸引力的策略。
——阻断免疫抑制
许多普遍的免疫抑制机制在体内起作用以控制自身反应性免疫反应和/或过度反应性炎症反应。与适应性免疫抵抗(AIR)机制相比，这些机制不一定由癌症甚至炎症诱导或促进，而是维持正常体内平衡所必需的。一个例子是TGFβ家族蛋白介导的免疫抑制。TGFβ家族分子具有广泛的正常生理功能，从伤口愈合到细胞分化。另一个例子是 Treg 细胞介导的免疫抑制，包括不需要的炎症和自身反应性。但Treg 细胞也可以通过CCL2和CCR4信号通路进入TME，成为肿瘤的“盟军”。在靶向Treg 细胞方面，抗CCR4单抗mogamulizumab能够消除循环 Treg 细胞，联合抗PD-1/PD-L1疗法治疗晚期实体瘤的临床试验(NCT02301130)正在进行中。CD39、CD73、腺苷和腺苷 A2a 受体都可能是耗尽Treg 细胞的潜在靶点。Treg 细胞耗竭的一个主要问题是其广泛的毒性，如在抗 CTLA-4 和抗CD25单抗治疗中所见的那样。因此，需要选择性地耗尽 TME 中的 Treg 细胞以避免广泛的不良事件。
髓系来源抑制性细胞(MDSCs) 会积极抑制免疫反应，包括抗肿瘤免疫。MDSCs靶向疗法正在被研究中，包括利用低剂量化疗、PI3Kγ抑制剂、组蛋白去乙酰化酶抑制剂、特异性抑制IL-4受体-α (IL-4Rα)或TRAIL受体的RNA适配体，或针对S100A9的多肽来耗尽它们或调节它们的活性。
此外，靶向肿瘤相关巨噬细胞(TAMs)的抗体已经被开发出来，包括针对CCL2、CSF-1R和CCR2的抗体。在TAMs上表达的PD-1可抑制吞噬作用，提示抗PD-1/PD-L1疗法也可能通过靶向TAMs发挥抗肿瘤作用。目前，这些药物正在临床试验中进行测试。
阻断这些普遍免疫抑制机制的一个主要问题是不良事件的高频发生。如前所述，这些机制通常是内在自身免疫或炎症的调节或控制所必需的。一些免疫检查点分子，如CTLA-4和TGFβ就属于这一类。但另一些“免疫检查点蛋白”，如LAG3、TIM3、IDO1和ICOS，似乎对正常生理功能贡献不大。这些蛋白的临床前肿瘤模型研究提供了一些特异性抑制剂的合理疗效数据，但在临床试验中，这些候选分子单药治疗时是无效的。在晚期人类肿瘤具有高度多样化的TME的背景下，一种可能的解释是，这些通路在TME中并不占主导地位，只发生在一小部分患者中。
——增强T细胞介导的免疫
抗PD-1/PD-L1疗法的主要作用是提高TME中原有的免疫，因此，一种思路是进一步提高系统性免疫，使效应T细胞持续向肿瘤部位供应。目前的研究方向包括将抗PD-1/PD-L1疗法与多种传统的免疫增强途径结合，如癌症疫苗、细胞因子疗法、T细胞过继疗法和共刺激疗法，以及将抗PD-1/PD-L1疗法与一些较新的策略结合，如DNA损伤药物、PARP抑制剂和表观遗传修饰剂，这些疗法也被认为通过不同的机制改变系统性免疫功能。以下详细讨论T细胞疗法和共刺激途径：
1、过继T细胞疗法
对于I型和IV型TIME肿瘤，过继T细胞疗法（包括CAR-T、TILs等）是增加T细胞在肿瘤部位浸润的一种有吸引力的方法。转移的T细胞通常是完全激活的，因此表达PD-1，并且通过TILs识别肿瘤抗原可能导致IFNγ和其他细胞因子诱导PD-L1在TME中的表达。理论上，这可以将I型和IV型TIME转化为II型，因此将抗PD-1/PD-L1疗法与过继T细胞疗法相结合是有意义的。除了TILs，用抗体和TCR改造的T细胞也可以作为抗PD-1/PD-L1疗法治疗实体瘤的有效组合。抗PD-1/PD-L1疗法与CAR-T细胞以及敲除共抑制分子的策略（如利用CRISPR–Cas9敲除CAR-T中的PD-1）的联合正在被测试中。
然而，抗PD-1/PD-L1疗法+过继T细胞疗法这种联合策略也存在一些障碍。首先，过继转移的T细胞在体外工程改造和通常旺盛的生长和激活过程后应保持迁移到肿瘤组织的能力。其次，输注的T细胞仍然可能在TME中遭遇未知的适应性免疫抵抗(AIR)机制，目前这很难预测。理想目标是能培养或改造出可抵抗多种适应性免疫抵抗(AIR)机制的T细胞。
2、T细胞共刺激
与T细胞过继疗法相似，共刺激可以极大地促进T细胞的扩增和活化。靶向共刺激途径的几种策略已经在各种动物模型中进行了测试，其中一些正在开展临床试验，有望增强癌症患者的免疫力。例如最近的临床试验显示了抗CD137单抗作为单药或联合抗PD-1/PD-L1疗法治疗晚期实体瘤的良好结果(NCT02179918, NCT02554812)。CD137（TNFRSF9，4-1BB）是一种TNFR超家族共刺激受体，在活化的CD8+T细胞、NK细胞、B细胞和树突状细胞上表达，但在静息细胞中表达极少。通过单抗激动剂，CD137信号可促进T细胞扩张和效应功能，刺激记忆T细胞形成并打破T细胞耐受。TNFRSF4(也被称为OX40或CD134)是另一种与CD137功能相似的TNFR超家族成员共刺激受体，尽管其共刺激作用似乎对CD4+T细胞更深刻。OX40和OX40L激动剂单抗目前也在临床试验中接受评估(NCT02219724, NCT02410512, NCT02221960)。
CD40和CD40L之间的相互作用向树突状细胞传递强烈的信号，大大增强T细胞的启动和随后的激活。一款CD40激动剂(CP-870,893)正在针对胰腺癌的I期临床试验中进行测试。虽然单药活性有限，但有明显的迹象表明T细胞启动和活化增强。一项与tremelimumab(抗CTLA-4)联合治疗晚期黑色素瘤的试验(NCT01103635)正在进行中。其他具有各种各样结合和药物特性的抗CD40抗体也正在开发中，如拮抗剂抗体HCD122 (lucatumumab)正在针对晚期非霍奇金或霍奇金淋巴瘤的I期临床试验中进行测试。大多数不良反应是轻度和中度的。滤泡性淋巴瘤的ORR为33.3%，黏膜相关淋巴组织边缘区淋巴瘤的ORR为42.9%，弥漫性大B细胞淋巴瘤的ORR为11.8%，霍奇金淋巴瘤的ORR为13.5%。Dacetuzumab是一种部分激动剂单抗，已被用于调查治疗多种血液系统恶性肿瘤，特别是复发性淋巴瘤、多发性骨髓瘤(NCT00231166)和实体瘤(NCT02225002)的效果。
小 结
如抗PD-1/PD-L1疗法所展示的，肿瘤诱导的适应性免疫抵抗(AIR)的发现，以及选择性阻断这些AIR机制的治疗策略的设计已经被证明对癌症患者有效。通过对人类TME的分析和分类，科学家们还发现了其他具有复杂特性和高度特异性的AIR机制，而这很可能仍只是冰山一角。理解以及靶向这些新的AIR机制应该能在不久的将来有效治疗更大比例的人类癌症。
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